تزریق به پیش هسته

موش­های تراریخت اغلب توسط تزریق DNA به پیش هسته­ی تخمک لقاح یافته­ی موش تولید می­شوند. برای تزریق سازه ژني (ترانس ژن) به درون جنین از یک پیپت شیشه­ای بسیار نازک استفاده می­شود. جای­گیری ترانس ژن درون ژنوم به صورت تصادفی است، و معمولا کپی­های متعددی از آن به صورت پشت سرهم در یک لوکوس کروموزومی وارد می­شوند. همیشه این امکان وجود دارد که ترانس ژن در موش تراریخت بیان نشود، و یا حتی ممکن است در بیان ساير ژن­های روی کروموزوم اخلال ایجاد کند.

به دنبال تزریق DNA، تخمک های لقاح یافته­ی دستکاری شده به اويداکت (لوله تخم بر) یک ماده­ی باردار شده کاذب (مادرخوانده) که قبلا در اثر جفت گیری با یک نر عقیم تحریک شده است، منتقل می­شوند.

شرح خدمات

• خریداری و نگه داری موش NMRI یا C57BL/6 برای توليد جنین­ها
• تحريک تخمک گذاری (سوپراوولاسيون) موش هاي ماده­ی (اهدا کننده) و جفت گیری آن با نرهای فعال
• ایجاد مادر خوانده از طریق جفت گیری ماده­های NMRI با نرهای عقیم شده و کنترل پلاک واژینال در صبح تزریق
• استحصال تخمک های لقاح یافته از موش هاي اهدا کننده
• رقیق سازی DNA در بافر تزریق جنینی به غلظت ng/µl 5-1 و تزریق آن به پیش هسته­ی تخک­های لقاح یافته
• انتقال تخم­های دست کاری شده به لوله­ی تخم بر موش هاي مادر خوانده
• کنترل کردن بارداري موش هاي مادر خوانده پس از انتقال جنین
• بیوپسی از دم برای بررسی ژنوتیپ توسط PCR (تهيه پرایمرها و شرایط PCR بر عهده مشتري مي باشد)

آماده سازي ترانس ژن

سازه­ی DNA به درون تخمک­های موش­ NMRI یا C57BL/6 (قیمت ها براساس نوع نژاد موش متغير است) تزریق خواهد شد. اگر نژادهای دیگری از موش مدنظر باشد ماده­ی دهنده و نرهای فعال باید توسط مشتري تهیه شوند. متقاضی بايد DNA خطی و خالص شده را با غلظت ng/µl 30 (به ميزان ml 10) تهيه کرده و همراه با عکس ژل که در آن باند DNA به وضوح نمایش داده شده ارسال نمايد. DNA پلاسمیدي باید بوسیله­ی کیت­های تجاری مانند کیت Qiagen endofree plasmid maxi استخراج شود. هیچ ضمانتی براي توليد موش تراريخت نيست مگر اینکه تمام پیش نیازها براي تزریق فراهم شوند. ما تضمین می­کنیم که تزريق طي دو نوبت انجام شده و حداقل یک بنیانگذار طی هر دوره تزریق DNA ایجاد شود.

افراد متقاضی می­توانند DNA خالص و خطی شده­ی را (همان طور که در بالا ذکر شد) برای ما ارسال کند. همچنین در صورت تمايل می­تواند باکتری حاوی پلاسمید مورد نظر را برای ما ارسال کند. تا استخراج و خطی سازی پلاسمید با کیفیت مطلوب به عنوان خدمتی جداگانه انجام شود. براي خطی سازی پلاسميد، آنزیم­های محدودکننده­ی اختصاصی بايد توسط مشتري تهيه شوند. همچنین متقاضیان می­توانند پلاسمید خالص شده با کیفیت بالا را برای ما ارسال کند تا ما خطی سازی را به عنوان خدمتی جداگانه انجام دهيم.

ملاحظات کلی در طراحی ترانس ژن برای تزریق پیش هسته

موش­های تراریخت با استفاده از طيف وسیعی از عناصر ژنتیکی شامل پروموترها، cDNA ها و ژن­های گزارشگر تولید می­شوند. ما عوامل مختلفي را که موفقیت آزمایش­های ترانسژنیک را تحت تاثیر قرار می­دهند، لیست کرده­ایم. اگر سوالی در مورد استفاده از توالی­های ژنی یا پروموترهای خاص در طراحی آزمایش خود دارید، می­توانید به طور مستقیم با مرکز ملي تحقيقات موش تراريخت تماس بگيريد.

تاثیر توالی های پروکاریوتی

وجود توالی های پروکاریوتی تاثيري بر بازده الحاق ژن به داخل ژنوم نمیگذارد، اما به طور گسترده ای در بیان ترانس ژن موثر است. بنابراین توصیه می شود که قبل از تزریق، تمام توالی وکتوري از سازه ترانس ژن جدا شود.

استفاده از cDNA

توالی های cDNA می توانند برای تولید موش های تراریخت مورد استفاده قرار گیرند. اما این توالی ها قابليت بيان کمتري نسبت به توالی های ژنومی از خود نشان می دهند. این تفاوت بخاطر وجود توالی های اینتروني درون ژنومی می باشد. به همین دلیل توصیه می شود که در ساختار های cDNA یک یا چند توالی اینترون قرار داده شود.

خلوص/غلظت DNA تزریق شونده

خلوص و غلظت سازه های تزریق شونده یکی از فاکتور های مهم در تضمین موفقیت آزمایش های تراريختگي می باشد. بدين منظور DNA باید عاری از هرگونه ناخالصی بوده و در بافر مناسب و غلظت ng/µl5-1 آماده شود. چون این یک مرحله بحرانی است، مرکز خدماتي را در خصوص خالص سازي و آماده سازي DNA انجام مي دهد.